مطالعه شناسايي Pseudomonas syringae در خاك و گياه با استفاده از روش تشخيص مستقيم توسط PCR

در اين تحقيق شناسايي Pseudomonas syringae بوسيله روش مستقيم PCR روي بافتهاي زنده گياهي، بقاياي خشك گياهي و خاك انجام گرفت. بدين منظور از گياهان آلوده خاك و بقاياي گياهي آلوده به باكتري كه يكسال از جدا كردن گياهان آلوده به P. syringae مي گذشت نمونه برداري انجام شد. نمونه ها در پلاستيك استوماشر محتوي 2 ميلي ليتر بافر PBS قرار داده شدند. از نمونه ها عصاره گيري به عمل آمده و سپس DNA سلولهاي باكتري خالص سازي شدند. پنج ميكروليتر از DNA خالص شده و 5 ميكروليتر ماده Gen Releser به لوله هاي اپندورف منتقل شده و عمل PCR به تعداد يك سيكل انجام گرديد. بلافاصله DNA باكتري توسط آغازگرهاي اختصاصي HrpL1 و HrpL2 مجددا عمل PCR به تعداد 37 سيكل تحت برنامه مخصوص انجام گرفت. DNA سلولهاي باكتريهاي تكثير شده روي ژل الكتروفورز منتقل شدند. تمامي نمونه ها تشكيل يك باند DNA با اندازه 600 جفت باز نشان دادند كه با شاهد مثبت كاملا مطابقت داشت. جهت تائيد نتايج، DNA تكثير شده با آنزيم برش Bsh 12361 هضم گرديدند و مجددا روي ژل الكتروفورز منتقل شدند. باندهاي ايجاد شده روي ژل با باندهاي شاهد مثبت كاملا مطابقت داشت. نتايج اين تحقيق بوضوح مشخص نمود كه سلولهاي P.syringae قادرند بيش از يكسال در خاك و بقاياي گياهي دوام داشته و از سالي به سال ديگر منتقل شوند.

Identification of Pseudomonas syringae in soil and plant materials by direct PCR

M. Niknejad Kazempour

Department of Plant Pathology Faculty of Agricultural Sciences, Guilan University

In this research, identification of Pseudomonas syringae on plant tissue, debris and soil by direct PCR method was examined. Soil and plant material contaminated by P.syringae for one year was collected. The samples were placed in stomacher plastics containing 2 ml PBS buffer. Extracts were prepared and the DNA was isolated. 5 μl of purified DNA was added to 5 μl of Gen Relesor in eppendorf tubes and a single cycle was carried. This was followed immediately by a 37 cyle PCR using the HrpL1 and HrpL2 primers. The DNA from PCR was electrophoresed and showed 600 pb fragment identical to the positive control. To verify this results, the amplified DNA was digested by restriction enzyme of Bsh 12361. The banding pattern attained correlated with those obtained for the positive control. The results obtained clearly demonstrate that P.syringae is capable sustaining itself for at least one year in soil and plant material and can be transmitted from one year to the next.